Bevezetés

Az ocularis mucosus membrán pem­phigoid (OcMMP) autoimmun betegség, amely a hegesedéssel járó kötőhártya-gyulladások közé tartozik. Az OcMMP a mucosus membrán pemphigoid (MMP) csoport tagja. Az MMP-n belül különböző altípusokat különítünk el a nyálkahártya-érintettség alapján. Érintheti az orális mucosát, az ocularis mucosát, a laryngealis mucosát, az oesophagealis mucosát, a trachealis mucosát, illetve a genitális és uro­genitális mucosát. Előfordulhat monosite (egy terület), illetve multisite (több terület) érintettség is (16).

Az OcMMP incidenciája körülbelül 0,7-0,8/millió lakos/év (16). Az átlag­életkor a diagnózisakor 60,4–68,2 év. Az átlagos idő az első tünetektől a diagnózis megszületéséig 225 nap és 6,4 év között változik (16).

A fő antigének, amelyek kiváltják az immunválaszt a bazális membrán zónában találhatóak: a6-integrin, ß4-integrin, laminin 332, VII-es kollagén, BP180, BP230 (16). Az OcMMP immunpatológiai előrehaladása három elkülöníthető fázisból áll:

• a sérülés fázisa,
• az akut gyulladás és
• sejtosztódás fázisa, illetve a fibrózis fázisa (10).

Klinikailag gyakran nem specifikus krónikus kötőhártya-gyulladással kezdődik. Előrehaladott stádiumban már nem a gyulladásos tünetek dominálnak, hanem a kötőhártya hegesedése és ennek a következményei: entrópium, canthus elsimulása, fornixrövidülés, symblepharon, ankyloblepharon, trichiasis, következményes látásromlással és akár vaksággal (16).

A diagnosztika a mai napig nem könnyű feladat. Klinikailag sok hasonló oculodermalis kórkép létezik (lineáris IgA-szindróma, pemphigus vulgaris, paraneoplasiás pemphigoid stb.) (1. ábra), és a mindennapi gyakorlatban elérhető diagnosztikai vizsgálatok szenzitivitása nem elég magas. A diagnosztikus késedelem miatt késve kapják meg a betegek a megfelelő terápiát, emiatt súlyosabb stádiumban kerülhetnek előszöri ellátásra (7). A pontosabb és gyorsabb diagnózisalkotáshoz hozzájárul az alapos anamnézisfelvétel, klinikai vizsgálat, szerológia, immunfluoreszcens vizsgálatok elvégzése, esetleg ABC immunhisztokémiai analízis és autoantitest-detektálás (17, 1). A direkt immunfluoreszcencia-vizsgálat (DIF) napjainkban az elsőként ajánlott kiegészítő diagnosztikai teszt (17). Ugyanakkor alacsony specificitása és szenzitivitása nem teszi lehetővé, hogy csupán DIF-teszt alapján megállapítsuk vagy kizárjuk az OcMMP-t (12). Az indirekt immunfluoreszcens vizsgálat ritkábban pozitív, mint a DIF-vizsgálat, ugyanakkor pozitivitás esetén felállítható a diagnózis, ezért kiegészítő vizsgálatként érdemes elvégezni (5, 17).

Célkitűzés

Jelen kutatás célja az intézetünkben hegesedő kötőhártya-gyulladás miatt gondozott betegcsoportokban elvégzett immunfluoreszcens diagnosztikai vizsgálatok eredményeinek felmérése.

Anyagok és módszerek

A Semmelweis Egyetem Szemészeti Klinikájának beteganyagából 23 beteg adatait vizsgáltuk 2008 márciusától napjainkig retrospektív módon, azonos feltételek szerint, akik diagnosztikus célból nyálkahártya-biopszián (kötőhártya alsó áthajlás, szájnyálkahártya) estek át hegesedő kötőhártya-gyulladás miatt.
Rögzítettük a nemek és az életkor megoszlását a biopszia idejében, valamint a betegség által érintett extraocularis nyálkahártya és bőr érintettségét. Összegyűjtöttük a direkt immunfluoreszcens vizsgálatok, az indirekt immunfluoreszcens vizsgálatok és amennyiben SSST is készült, annak eredményeit. Az adatok gyűjtésére az e-MedSolution rendszert használtuk. A réslámpás képeket a Szemészeti Klinika készítette és szolgáltatta. A DIF-tesztek a Bőr-, Nemikórtani és Bőronkológiai Klinika Immunfluoreszcencia laboratóriumában kerültek kiértékelésre. Az indirekt immunfluoreszcens vizsgálatok majomnyelőcső-szöveten készültek és szintén Bőr-, Nemikórtani és Bőronkológiai Klinika Immunfluoreszcencia laboratóriuma értékelte ki őket.

Biopsziafeldolgozás és analízis

Direkt immunfluoreszcens vizsgálat

A mintavételt a betegek előzetes tájékoztatása után, a beleegyező nyilatkozat aláírását követően végeztük, a Helsinki Deklarációnak megfelelően. Felszíni érzéstelenítés (Novesine 0,4%-os szemcsepp, Oxibuprocain, Novartis) és subconjunctivális lidocain (20 mg/ml, EGIS) injekció után minden esetben az alsó áthajlás hegmentes részéből történt a kötőhártya-mintavétel.
A mintát a feldolgozásig PBS (pH=7,4) transzportfolyadékban tároltuk 4 °C-on, maximum 24-48 óráig. Az immunológiai laboratóriumban a mintákat –20 °C-on kriogélbe (crymatrix) ágyaztuk. Feldolgozáskor az előkészített mintát 3 oldalról körbevágták és leválasztották a tárgylemezről, alumíniumlapra ragasztották, rögzítették a crytome-ban, majd 8 db, 2-10 mikrométer vastag szeletet vágtak –20 °C-on. Két-két metszet került egy tárgylemezre. Szárítás és jelölés után FITC-vel konjugált, nyúlban termelt humán IgA, IgG, IgM, C3 (kötőhártyaminta esetén IgG4 is) ellenes antitestekkel inkubálták 30 percig, sötétben, szobahőmérsékleten. PBS-es mosás után 1:1 arányú glicerines PBS-t cseppentettek a metszetre, majd ráhelyezték a fedőlemezt. Ezután mikroszkóp alatt kiértékelték a mintákat.

Indirekt immunfluoreszcens vizsgálat

A betegtől vett 2-5 ml teljes vérminta centrifugálása után a savót használták fel a vizsgálathoz, hogy azonosítsák a keringő antitesteket. Antigén-szubsztrátnak majomoesophagust használtak. Első lépésben a szubsztrátokat elárasztották 30 mikroliter 0,1-es és 0,01-os hígítású savóval, majd 30 percig inkubálták párakamrában szobahőmérsékleten, majd kétszer 10 percig leöblítették PBS-sel (TWEEN20). Ezt követően a mintát 30 percig, sötétben, szobahőmérsékleten inkubálták 30 mikroliter FITC-hez kötött másodlagos antitesttel (IgG). Ezután a szöveteket még kétszer lemosták 10 percig PBS-sel (TWEEN20), végül glicerines fedőréteg és fedőlemez került a mintákra, és mikroszkóp alatt kiértékelésre kerültek.

Salt-split skin technika

A vizsgálathoz majombőr-mintát használtunk, egy éjszakára 1M NaCl-oldatba áztattuk. A direkt immunfluoreszcens vizsgálat során a mintákat humán IgA-, IgG-, IgM-immunglobulin és C3-komplement elleni savóval reagáltattuk, amely antitestek FITC-hez voltak konjugálva.

A minta negatív amennyiben nem látunk festődést egyetlen antiszérum esetén sem, pozitív, amennyiben festődést látunk bármelyik antiszérum hozzáadása után. Előfordulhat lineáris festődés a BMZ-ben, intercelluláris festődés, „shaggy” festődés, szemcsés festődés, vaszkuláris festődés és egyéb. A festődésmintázat és a -lerakódás segít a diagnózis felállításában.

Eredmények

Kutatási populáció

A 23 fős csoportból 15 nő volt (65,2%) és 8 férfi (34,8%). Az OcMMP-csoportban 6 nő volt (46,2%) és 7 férfi (53,8%). Azok között, akik esetében más diagnózis derült ki, 3 nő és 1 férfi volt. Az egyelőre diagnózis nélküli csoport tagjai (6 eset) mind nők.

A medián életkor a mintavétel idejében 70 év volt (min. 45, max. 85), Az OcMMP-sek körében 61 év (min. 45, max. 85), az egyéb diagnózisú betegek között 71,5 év (min. 60, max. 74) és a nem diagnosztizáltak esetében 73,5 év (min. 64, max. 77). 13 páciens DIF-pozitivitással igazolt OcMMP-s (56,5%), 1 páciens pemphigus vulgarisos (4,3%), 1 páciens paranaoplasias pemphigoidos (4,3%), 1 páciens lineáris IgA-dermatosisos (4,3%), 6 beteg továbbra is diagnózisra vár (26,1%). Az ocularis MMP-populációból 5 betegnek volt szájnyálkahártya-érintettsége (38,5%), 2-nek orr­nyálkahártya-érintettsége (15,4%), 1-1-1-1 betegnek, garat-, íny-, bél-, gége érintettsége (7,7-7,7-7,7-7,7%) és 3-nak bőr érintettsége (23,1%). A nem OcMMP diagnózisúak közül 4-nek volt szájnyálkahártya-érintettsége, 1-1-1-nek orrnyálkahártya-, íny- és hereérintettsége és 2-2-nek garat- és bőrérintettsége.

Akik esetében még nem született diagnózis semmilyen extraocularis érintettséggel nem rendelkeznek (1. táblázat és 2. táblázat). 22 betegnek volt kétoldali szemérintettsége (95,7%) és egynek féloldali (4,3%).

Direkt immunfluoreszcencia- eredmények

Minden betegnél készült direkt immunfluoreszcens vizsgálat, de 4 esetben ismételt vizsgálatra is szükség volt, 2 esetben kötőhártyából, 1 esetben szájnyálkahártyából, 1 esetben bőrből történt az ismételt mintavétel. A DIF-teszt összesen 30-szor került elvégzésre és 16-szor lett pozitív (53,3%). Ezek során a C3, IgG, IgA és IgM jelenlétét vizsgálták, egyes minták esetében az IgG4-et is.
Az OcMMP-s betegek tesztjei közül a bazális membrán zónában 13 esetben volt látható lineáris IgG-lerakódás (100%), 9 esetben volt lineáris C3-komplement-lerakódás (69,2%), 6 esetben volt lineáris IgA-lerakódás (46,2%) és 2 esetben volt lineáris IgG4-lerakódás (2. ábra).

A 4 egyéb diagnózist kapott beteg DIF-vizsgálata is mutatott eltéréseket. A pemphigus vulgarisos beteg DIF-tesztjén tipikus intercelluláris IgG- és C3-lerakódás figyelhető meg. A paraneoplasiás pemphigoidos beteg tesztjén lineáris IgG-lerakódás volt észlelhető a bazális membrán mentén (3. ábra). A bullosus pemphigoidos beteg tesztjén lineáris IgG-lerakódás volt a bazális membrán zónában. Az IgA-dermatosissal rendelkező beteg tesztjén pedig lineáris IgA-lerakódás detektálható szintén a bazális membrán mentén (4. ábra, 1. táblázat, 3. táblázat).

Indirekt immunfluoreszcencia-­eredmények

Az IIF-teszt 11 esetben került elvégzésre és 4 esetben lett pozitív (36,4%), 1 esetben OcMMP-s betegnél, 3 esetben nem OcMMP-s betegnél. A 11 teszt 10 beteghez tartozik (1. táblázat és 3. táblázat).

Salt-split skin teszt eredménye

Salt-split skin tesztet 1 esetben végeztünk, a paraneoplasiás pemphigoidos beteg esetén. Lineáris epidermalis festődés figyelhető meg rajta (5. ábra).

Megbeszélés, következtetések

Az OcMMP egy látást veszélyeztető autoimmun betegség, amely hosszú távú szisztémás gyulladáscsökkentő terápiát igényel a progresszió mérséklése céljából. A betegség általában progresszív hegesedő kötőhártya-gyulladásként jelentkezik, és a differenciáldiagnózisa kihívást jelent a szemészek számára. Kötőhártya-biopszia szükséges (annak eredménytelensége esetén szájnyálkahártya-, esetleg bőrmintavétel) a diagnózis felállításához, továbbá a megfelelő terápia kiválasztásához. A szisztémás terápia számos mellékhatást okozhat, főleg idősebb korosztályban, ezért is ideális a biopszia által bizonyított diagnózis, amely megalapozottabb kezelést tesz lehetővé.

A vizsgálati csoportunkban a férfiak gyakrabban érintettek az OcMMP-ben (53,8%). Radford és munka­társai kutatásában szintén férfi többség volt (58%) (14). Az autoimmun betegségekben viszont általában női túlsúly figyelhető meg (13).

Ez a betegség többnyire az idősebb korosztályt érinti (14, 16), ebben a kutatásban a medián életkor az OcMMP-diagnózis felállításának idején 61 év volt, az életkori megoszlás pedig 45 és 85 év között változott.

Három csoportra osztottuk a 23 fős betegpopulációt a DIF-vizsgálat eredménye alapján: OcMMP-s betegek; nem OcMMP-s, egyéb oculodermalis kórképben szenvedő betegek; és a vizsgálat idejében definitív diagnózissal nem rendelkező betegek. Ez utóbbi csoportban továbbra is törekszünk diagnózisalkotásra. A felosztásunk oka az, hogy az OcMMP messze a leggyakoribb szemészeti érintettséggel járó kórkép az összes oculodermalis kórkép közül és önmagában is gyakoribb az előfordulása a többi kórképhez képest. Egy beteg mindaddig progresszívnak tekintendő, amíg az ellenkezőjét nem tudtuk igazolni. DIF-negativitás esetén ismételjük a mintavételt kötőhártyából. További negativitás esetén ismételjük szájnyálkahártyából. Ha ez sem vezet eredményre, elvégezzük az IIF- és SSST-vizsgálatokat (17).

Ebből a betegcsoportból, 23 esetből 13 betegnél lett OcMMP a végső diagnózis (56,5%), tehát a hegesedő kötőhártya-gyulladásért nagy százalékban az OcMMP tehető felelőssé.
A direkt immunfluoreszcencia-vizsgálat napjainkban az elsőként ajánlott kiegészítő diagnosztikai teszt (17). Ennek megfelelően a mi betegpopulációnkban is minden esetben elvégeztük. Összesen 30 DIF-teszt készült, amelyből 16 lett pozitív (53,3%). A DIF alacsony szenzitivitása és specificitása (12) nem teszi lehetővé, hogy csupán DIF-teszt alapján megállapítsuk vagy kizárjuk az OcMMP-t, ugyanakkor közelebb visz a diagnózishoz és a megfelelő terápia kiválasztásához, ezért krónikus kötőhártya-gyulladásban mindenképp ajánlott a DIF elvégzése a terápia beállítása előtt.
Ez a kutatás az OcMMP-s betegek körében azt találta, hogy az IgG-lerakódás fordult elő leggyakrabban (100%), majd következett a C3 (69,2%), végül pedig az IgA (46,2%). C3 komplement- és IgA-antitest-lerakódás nem fordult elő önmagában, csak IgG-antitesttel együtt, vagy mindhárom együttesen. IgG, C3-komplementtel együtt gyakrabban volt jelen, mint IgG-, IgA-antitesttel.
Frith és munkatársai lineáris IgG-, IgA-, IgM- vagy C3-lerakódást az esetek 46%-ában regisztráltak (9). Bernauer és munkatársai lineáris C3- vagy immunoglobulin-lerakódást az OcMMP-s betegek 50%-ában találtak. Továbbá azt figyelték meg, hogy IgA-lerakódás fordul elő a leg­gyakrabban (91%), majd a C3 (54%), végül az IgG (45%) (3). Chan és munkatársai szintén magasabb arányú IgA-lerakódást figyeltek meg, és kisebb arányú IgG-, C3-lerakódást (6). Mehra és munkatársai az IgG-lerakódást figyelték meg leggyakrabban (47,1%), ezután az IgA (25,5%), majd a C3-lerakódást (14,7%) (12).

A mintavétel helye (lézionális, nem lézionális) szintén befolyásolja a DIF-teszt pozitivitását, Mehra és munkatársai magasabb szenzitivitásúnak és specificitásúnak találták azokat a mintákat, amelyeket nem lézionális területről nyertek, és még magasabb értékeket kaptak nem lézionális bőrmintákra (12). Schmidt és munkatársai azt javasolják, hogy amennyiben lehetséges a biopsziát ne gyulladt kötőhártyából vegyük, mivel ez csökkenti a szenzitivitást (17). Dart és munkatársai azt találták, hogy a nem lézionális bőr hasonló eredményekkel szolgál, mint a nem gyulladt kötőhártya, továbbá a buccaból nyert minta pozitív lehet, amikor a kötőhártyaminta negatív (7).

Saját beteganyagunkban a 13 OcMMP-s betegből 11-nek elsőre pozitív lett a DIF-tesztje, 1 betegnek másodjára lett pozitív, 1 betegnek pedig csak negyedik alkalommal. Több egyidejű mintavétel, illetve a mintavétel ismétlése növelheti a diagnózis felállításának valószínűségét (18).

Az összes elkészített DIF-teszt közül, 6-ot nem lehetett megfelelően értékelni, mivel 3 esetben lízis volt megfigyelhető, 1 esetben nem tartalmazott hámot a minta, 2 esetben pedig túl kicsi volt a minta. Ebből 4 esetben rebiopszia történt, 2 esetben új mintavétel még nem történt, de a továbbiakban tervezett.

Egyes centrumok között különbségek figyelhetőek meg a DIF-teszt diagnosztikus relevanciája között, amely gyakran a mintavétel sebészi technikájának és a minta kezelésének különbségére vezethető vissza. A kötőhártya-epithelium egy nagyon finom szövet, könnyen roncsolható és leválasztható az alatta fekvő strómáról, értékelhetetlenné téve a mintát (1). Emellett a betegség természete szerint a bazális membrán széttöredezés miatt eleve hiányozhat a mintából (8). A minta tárolása hűtőben, 4 °C-on maximum 48 óráig lehetséges, mivel hosszabb idő alatt a sejtpusztulás mértéke olyan nagy, hogy az analízishez nem marad elegendő élő sejt. A minta analízise több okból lehet sikertelen. Lehetséges okok a nem megfelelő méretű vagy minőségű minta (elegendő epithelium és BMZ kell, hogy jelen legyen), a minta eltérő kezelése (gyorsfagyasztás, Michel-transzport médium, sós gézlapokra helyezés, majd késleltetett fagyasztás), továbbá nem megfelelő antitestek alkalmazása. A technika reprodukálhatósága elengedhetetlen a megbízható diagnózisalkotáshoz. A patológiai laboratórium szintén kulcsszerepet játszik a kötőhártya-biopszia feldolgozásában. A patológusoknak jártasnak kell lenniük ezeknek az apró és sérülékeny mintáknak a kezelésében, hogy megőrizzék az anatómiai integritást a megfelelő elemzéshez (1).
Anesi és munkatársai javasolják az avidin-biotin-komplex immunoperoxidáz (ABC) immunhisztokémiai analízis elvégzését, amely növeli a szenzitivitást diagnózisalkotás során, amikor a DIF-biopszia negatív vagy nem egyértelmű (1).

Az SSST szintén akkor használatos, ha bizonytalanság van, tovább növeli a diagnózishoz jutás esélyét. SSST során ép emberi bőrt, vagy majombőrt használunk, ellenben az IIF-teszthez majomoesophagust használunk szubsztrátként. Ez magyarázhatja a SSST szignifikánsan magasabb pozitivitását OcMMP-s pácienseknél, IIF-fel szemben (17).

Indirekt immunfluoreszcens vizsgálat 11 alkalommal készült és 4 esetben lett pozitív. Ebből 1 alkalommal OcMMP-s beteg szérumából, 3 alkalommal pedig más betegséggel diagnosztizált betegek szérumából (pemphigus vulgaris, bullosus pemphigoid, paraneoplasiás pemphigoid). Arbache és munkatársai az IIF-vizsgálat eredményeit kutatták és azt találták, hogy fontos diagnosztikus eszköz az autoimmun betegségek diagnosztizálásához. Pemphigusos betegeknél nagyobb arányban mutat pozitivitást, mint pemphigoidos betegeknél (2). Kiegészítő diagnosztikus vizsgálatként érdemes elvégezni.

A nem OcMMP-s betegcsoportban, arányaiban gyakrabban fordult elő bőr- és egyéb nyálkahártya-érintettség. Pemphigus vulgarisban a bőrérintettség hólyagokban vagy erythemás területekben nyilvánul meg, különösen a fejbőrön, arcon, hónaljban, törzsön és az ágyékon. OcMMP-ben a bőrléziók ritkák és a nyálkahártya-manifesztációk után jelennek meg, továbbá gyakrabban érintik a fejet, nyakat és a felsőtestet (15). A szájüreg, különösen a buccalis nyálkahártya, lágyszájpad és ajkak érintettek elsőként a pemphigus vulgarisos betegek 50-80%-ában, és az MMP-s betegek 90%-ában (4). Abban a csoportban, akiknél nem született diagnózis, egyáltalán nem fordult elő extraocularis érintettség. Monosite OcMMP-ben (csak a szemet érintő MMP) a negatív DIF-eredmények régóta problémát jelentenek (7).

Figyelemre méltó, hogy az OcMMP-s páciensek 7,7%-ának anamnézisében szerepel szemészeti mű­tét, illetve 15,4%-ban szerepel glaukóma. A betegcsoportunkban az egyik beteg anamnézisében szemészeti műtét mellett maródásos sérülés (hipós víz is fröccsent a szemébe) is szerepel. Ezek a betegség triggerelésében lehetnek fontosak. Felmerül ugyanis egy olyan mechanizmus, ahol a kötőhártya sérülése következtében, bazális memb­ránepitópok szabadulnak fel, amelyek aztán neoantigénekként viselkednek, és autoimmun folyamatot indítanak be, MMP-t eredményezve (7). A szemműtétek di­rekt traumával járnak, a glaukómás betegeknél a tartósítószert tartalmazó készítmények állandó használata szintén károsíthatja a BMZ-t, illetve nehezítheti a differenciáldiagnózist (7). A kezelésben használatos lokális és szisztémás szteroid is mellékhatásként szekunder glaukómát okoz arra hajlamos betegekben (11).

Ennek a kutatásnak a korlátai, hogy retrospektív és alacsony a betegszám. Ennek ellenére, ha figyelembe vesszük az OcMMP alacsony incidenciáját, és Magyarország alacsony népesség számát, relatíve nem kevés betegről van szó.

Nyilatkozat

A szerzők kijelentik, hogy eredeti közleményük megírásával kapcsolatban nem áll fenn velük szemben pénzügyi vagy egyéb lényeges összeütközés, összeférhetetlenségi ok, amely befolyásolhatja a közleményben bemutatott eredményeket, az abból levont következtetéseket vagy azok értelmezését.